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除菌过滤产品在单克隆抗体工艺中应用

关于单克隆抗体

1.抗原(Antigen)

 

在介绍抗体之前,我们首先来认识一下抗原是什么?抗原是指能够刺激机体产生(特异性)免疫应答,并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合,发生免疫

 

2.抗体(Antibody)

抗体指机体的免疫系统在抗原刺激下,由B淋巴细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。

 

3.单克隆抗体以及开发历程


单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)是B细胞产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。用来鉴别和清除外源物质如细菌、病毒等的一种“Y”形免疫球蛋白。通常,天然抗体由两条重链H链)和两条轻链L链)构成。重链较长、相对分子量较大;轻链较短、相对分子量较小;链间由二硫键和非共价键连接形成一个的单体分子。整个抗体还可进一步分为恒定区C区)和可变区V区)两部分。

 

 

 

 

 

 

单克隆抗体制备中的技术

 

 

1975年,英国科学家Kohler和Milstein 首次将寿命长但不能产生特异性抗体的小鼠骨髓瘤细胞与寿命短但经免疫后可产生特异性抗体的浆细胞(绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞)在体外进行融合,创建了杂交瘤技术,得益于该技术,mAbs才实现了大量制备,用于基础研究,并具备临床转化能力,开启了单克隆抗体药物开发的新纪元。

下图所示为单克隆抗体的经典制备方法,向小鼠体内注射特定抗原以引发免疫反应,得到相应的B淋巴细胞,将其和小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选后把获得的杂交瘤细胞在体外大规模培养,扩增单克隆抗体。

 

 

单克隆抗体开发的四个阶段

 

 

单克隆抗体的发展主要经历了四个阶段:鼠源性单克隆抗体、人鼠嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。由于鼠源性抗体适用于人体时总会产生这样那样的不良反应,因此人源化抗体才是未来药物的发展趋向。

单克隆抗体的应用

 

 

检验医学诊断试剂:广泛用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化、流式细胞等技术。并且单克隆抗体的应用,很大程度上促进了商品化试剂盒的发展,广泛用于抗原抗体、激素、细胞因子等的检测。

 

蛋白质提纯:作为亲和层析中的重要配体,制备成层析柱,实现蛋白质的分离纯化。

 

肿瘤的导向治疗和放射免疫显现技术:利用单克隆抗体的导向作用,将药物与单克隆抗体连接导向靶细胞,直接杀伤靶细胞;以及将放射性标记物与单克隆抗体连接进行放射免疫显像。

 

单克隆抗体工艺的过滤解决方案

 

 

 

单克隆抗体的生产工艺阶段,主要有上游细胞的培养过程、细胞培养液的收获和澄清过程、下游分离纯化过程。其中上游细胞培养完成后所获得的含有抗体的细胞培养液会含有蛋白酶、宿主细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸及培养基与加料液成分等污染物,影响抗体的稳定性和纯度,需要经过去除使细胞液澄清后才能用于后续的抗体分离纯化过程;下游的分离纯化的主要目的是将抗体与工艺相关杂质和产品相关杂质分离,最终获得高纯度、低潜在危害的抗体药物。

 

上游细胞的培养过程:

下游工艺过程-三步层析法:

其中过滤在其的不同工艺阶段都有很广泛的应用,主要有培养基的除菌过滤、气体的除菌过滤、缓冲液的除菌过滤、死细胞和细胞碎片的澄清过滤,超滤浓缩、层析纯化、终端产品的除菌过滤、除病毒过滤等。

 

20000L的生产流程:

传统单克隆抗体制备工艺流程图:

 

其主要的过滤位点有:

1.培养基过滤:去除细胞培养基中细菌和微生物;

2.呼吸器/气体过滤:气体的除菌过滤主要应用于生物反应器的进气及排气过滤,各种储罐及配料罐的呼吸器等,主要是去除气体中的细菌等微生物;

3.ATF:切向流过滤,去除死细胞和细胞碎片以及脂类、胶体、颗粒等杂质去除;

4.缓冲液过滤:缓冲液的除菌过滤,延长层析柱和超滤膜使用寿命;

5.保安过滤:超滤前预过滤,保护超滤模组;

6.终端除菌过滤:去除终端滤液中细菌和微生物。

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